Salud

Cáncer de colon: desarrollo e implementación de estudios moleculares para diagnóstico en Mendoza

El cáncer de colon y recto también llamado cáncer colorrectal (CCR) es un tumor maligno que se desarrolla en la última porción del tubo digestivo (el intestino grueso). Se produce por alteraciones en el ADN de las células de la mucosa del intestino que las llevan a multiplicarse en forma descontrolada. La patogénesis del CCR es extremadamente compleja y diversa y es influenciada por múltiples factores relacionados a la dieta, el estilo de vida y la genética.

El 90% de los cánceres colorrectales se producen en personas mayores de 50 años de edad con una incidencia levemente mayor en hombres que en mujeres. Alrededor del 75% de los casos de CCR son esporádicos, es decir que se desarrollan en personas que no presentan antecedentes personales ni familiares de la enfermedad. El 25% restante se producen en personas con riesgo aumentado debido a antecedentes de adenomas únicos o múltiples, enfermedad inflamatoria intestinal y antecedentes familiares de cáncer colorrectal o de adenomas. (Figura 1)

Figura 1. Distribución de casos de cáncer colorrectal según los antecedentes del paciente.

Algunas estadísticas

En nuestro país el cáncer colorrectal (CCR) se ubica en segundo lugar en incidencia con 11,8% de los casos luego del cáncer de mama con 16,8% y en tercer lugar se ubica el cáncer de próstata (9,7%). Las estimaciones de la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer (IARC) para el año 2012 arrojaron 13.558 nuevos casos en Argentina, de los cuales 7.237 fueron hombres y 6.321 mujeres.

El CCR causó en 2014, 7.327 muertes en Argentina, el 12% del total de muertes por tumores malignos, ubicándose en el segundo lugar luego del cáncer de pulmón con 9.340 muertes (15,3%) y precediendo al cáncer de mama que produjo 5.700 defunciones (9,3%).

Alteraciones genéticas en cáncer colorrectal no polipósico (CCHNP)

Entre el 3 y el 8% de los casos de cáncer colorrectal son producidos por mutaciones heredables en genes puntuales y constituyen los distintos síndromes de cáncer colorrectal hereditario. El más común de ellos es el Síndrome de Lynch o Cáncer Colorrectal Hereditario no Polipósico (CCHNP). Los pacientes afectados tienen un riesgo superior al 80% de desarrollar cáncer de colon y en mujeres, el riesgo de desarrollar cáncer de endometrio es de 60%. También se encuentra incrementado el riesgo de padecer cáncer de estómago, de ovario, de intestino delgado, de vías biliares, de riñón, de páncreas y de cerebro.

La patogénesis del Síndrome de Lynch se relaciona con fallas en el sistema de reparación del ADN o DNA MisMatch Repair (MMR). El sistema MMR está formado por un conjunto de proteínas que reconocen y reparan los errores cometidos en la formación del ADN durante la replicación (proceso por el cual el ADN se duplica previo a la generación de nuevas células) que escapan al control inicial de la enzima encargada de la replicación, la ADN polimerasa. Los genes descriptos que dan origen a estas enzimas son llamados: MLH1, MSH2, MLH3, MSH6, PMS1 y PMS2 y se han  detectado mutaciones en todos ellos que llevan a su inactivación y pérdida de función de la proteína. Las mutaciones en MLH1 y MSH2 representan el 80- 90% de las mutaciones encontradas en pacientes con Síndrome de Lynch.

Las alteraciones en el sistema de reparación del ADN llevan a la acumulación acelerada de mutaciones puntuales (involucran un único nucleótido) y cambios en la longitud de microsatélites (secuencias repetitivas en el ADN), fenómeno conocido como Inestabilidad de Microsatélites (MSI).

La evaluación de la presencia o ausencia de Inestabilidad de Microsatélites en tumores colorrectales al momento del diagnóstico de CCR, tiene una gran utilidad para el buen manejo del paciente y el asesoramiento familiar.

Se llama MSI alta (MSI-High) cuando dos o más de los marcadores microsatélites estudiados presentan diferencias de tamaño entre el tejido sano y el tumoral (Figura 2). Este resultado se detecta en más del 85% de los CCR que ocurren en familias con CCHNP. Además, puede detectarse en el 10 al 15% de los casos de CCR no asociados a CCHNP, que pierden la función MMR debido a silenciamiento por metilación de los genes de reparación del ADN (un cambio químico en el ADN no heredable que impide que el gen se exprese).

Figura 2. Electroferogramas obtenidos a partir de la PCR multiplex de 8 microsatélites evaluados. A. Muestra de mucosa sana. B. Muestra de mucosa tumoral perteneciente al mismo paciente con inestabilidad en los ocho marcadores (MSI-H).

Selección de pacientes para estudios moleculares

La presencia de MSI puede ser un fuerte indicio de Síndrome de Lynch si se asocia a los criterios de Bethesda. Estos criterios se establecieron luego de muchos estudios y reuniones de especialistas que determinaron las características que reúnen los pacientes con sospecha clínica de CCHNP.

Estos criterios permiten seleccionar familias con sospecha clínica de Síndrome de Lynch en las cuales es necesaria la realización del estudio genético para detectar inestabilidad de microsatélites y/o inmunohistoquímica en tejido tumoral para luego continuar con la investigación de mutaciones en los genes candidatos. Actualmente, existen varios grupos, entre ellos el Evaluation of Genomics Applications in Practice and Prevention (EGAPP) working group, que abogan por el estudio universal de MSI a pacientes con cáncer colorrectal para aumentar la detección de CCHNP. Este grupo encontró que el 2-4% de los pacientes con CCR recientemente diagnosticados padecen de Síndrome de Lynch y el screening redundaría en una reducción de la morbi-mortalidad en familiares del paciente.

Los tumores colorrectales con MSI-H tienen características definidas, entre ellas, predominio de afectación del colon proximal, infiltrado linfocitario y apariencia poco diferenciada, mucinosa o en anillo de sello. Por otro lado, presentan un mejor pronóstico que los tumores sin MSI y tienen diferente respuesta a la quimioterapia. Varios estudios han demostrado que los tumores MSI-H no responden a la terapia con fluoropirimidinas, tales como 5- Fluorouracilo y Capecitabina. No obstante esto, pueden ser sensibles a Irinotecan y Mitomicina C. El descubrimiento de la MSI en CCR ha incrementado el conocimiento de la diversidad de los cánceres colorrectales y ha mejorado sus implicancias en el tratamiento de los pacientes.

El Cáncer Colorrectal es uno de los cánceres más factibles de prevenir: la progresión lenta del adenoma hacia la malignidad permite, mediante exámenes periódicos de pesquisa, detectar y extirpar los pólipos. Así, se logra prevenir la enfermedad con significativa disminución de la incidencia. Además, si se logra detectar en una fase temprana, las posibilidades de curación son superiores al 90% y los tratamientos son menos invasivos. Sumado a esto, se deben considerar los beneficios, tanto económicos como operativos que la detección temprana brindan al sistema de Salud Pública.

Las características clínicas relacionadas con la forma de aparición, edad de diagnóstico y antecedentes familiares, permiten orientar el caso en estudio y son herramientas fundamentales para la derivación de pacientes hacia una consulta de evaluación y caracterización más exacta del riesgo.

La identificación de los casos de cáncer familiar y hereditario permite estratificar a la población de acuerdo al riesgo de desarrollar la enfermedad y establecer estrategias  de prevención efectivas.

El asesoramiento genético, la valoración del riesgo y el seguimiento clínico de estas familias, requiere el accionar de grupos interdisciplinarios y es considerado una parte esencial del manejo clínico oncológico.

Aspectos metodológicos

El trabajo consistió en el diseño y puesta en marcha de una técnica molecular para diagnóstico de MSI. Para ello se desarrolló una PCR multiplex de ocho sistemas microsatélites con detección por electroforesis capilar (Figura 2).

Se incluyeron en el estudio 33 pacientes con CCR menores de 70 años que aportaron muestras de sangre periférica o tejido de colon sano y tejido tumoral a partir de los cuales se obtuvo ADN. También se solicitaron los antecedentes personales y familiares de CCR u otros tumores y resultados de los análisis de anatomía patológica e inmunohistoquímica.

La inmunohistoquímica es una técnica que permite detectar determinadas proteínas  en un tejido mediante el uso de anticuerpos específicos contra dichas proteínas. En el caso del CCR, se buscan las proteínas que reparan el ADN (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2). La ausencia de alguna de estas proteínas puede deberse a mutaciones en los genes que impiden que se expresen en los tejidos y cumplan con su función de reparar errores en el ADN.

Los resultados obtenidos con la PCR desarrollada en el laboratorio correlacionaron con los resultados de inmunohistoquímica. En todos los casos que, por inmunohistoquímica, se observaron las cuatro proteínas correspondientes a las enzimas de reparación del ADN (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2), los pacientes fueron estables en todos los microsatélites evaluados. Mientras que los casos con ausencia de algunas de las proteínas, los pacientes presentaron MSI-H. En dos casos se obtuvo MSI-H con las cuatro proteínas presentes, hecho que puede estar relacionado a defectos en MSH6 o a mutaciones que afectan la  función de la proteína pero que igualmente puede ser detectada por inmunohistoquímica. Esto remarca la importancia de realizar MSI junto a la inmunohistoquímica para detectar estos casos.

La determinación de MSI es un estudio que debe realizarse de rutina en los pacientes afectados de cáncer colorrectal como prueba de screening para Síndrome de Lynch o Cáncer Colorrectal Hereditario no polipósico (CCHNP).

El Síndrome de Lynch requiere un abordaje interdisciplinario que incluya la participación de médicos cirujanos, oncólogos, anatomopatólogos, gastroenterólogos, genetistas y especialistas en biología molecular diagnóstica. Es necesario seguir un algoritmo diagnóstico preciso que permita la pesquisa de todos los pacientes con cáncer de colon para mejorar la detección de posibles afectados por Síndrome de Lynch.

Futuras investigaciones en este tema son necesarias para mejorar el diagnóstico de CCHNP y consecuentemente el asesoramiento genético que el paciente y su grupo familiar necesitan. En este aspecto, se plantea continuar el análisis de pacientes para evaluar el comportamiento de esta técnica y poder determinar la incidencia de Síndrome de Lynch en la población de la región de Cuyo. Los resultados se podrán correlacionar a los obtenidos por inmunohistoquímica y, en conjunto, orientarán el estudio molecular específico para la búsqueda de mutaciones en los genes implicados en esta patología.

Implicancia en políticas públicas

La metodología desarrollada en este trabajo representa una técnica innovadora, altamente sensible y específica para la detección de MSI y podrá ser aplicada a bajos costos debido a que no será necesaria la compra de un reactivo comercial importado. Esto aumentará las posibilidades de que un mayor número de pacientes pueda acceder a este estudio. Para ello, también será necesaria la difusión de esta metodología en la región, acción que ya se viene ejecutando durante todo el desarrollo del trabajo, informando a grupos de oncólogos, gastroenterólogos y cirujanos de distintas instituciones de la provincia sobre la disponibilidad de la misma.

Teniendo en cuenta la metodología disponible en la región de Cuyo se podría plantear el siguiente algoritmo diagnóstico para pacientes afectados con Cáncer colorrectal:

Figura 3. Algoritmo diagnóstico para cáncer colorrectal

Según este algoritmo, todos los pacientes menores de 70 años serían derivados al screening por MSI e Inmunohistoquímica ya disponibles en la región. Si ambas pruebas son negativas, esto es, microsatélites estables y expresión conservada de las cuatro proteínas de reparación del ADN, se descarta el diagnóstico de Síndrome de Lynch y no son necesarios nuevos estudios. Si, en cambio, se detecta MSI-H acompañado de la ausencia de MSH1 en la inmunohistoquímica, será necesario continuar con el estudio de mutaciones en el gen BRAF y/o estudio de metilación en MLH1. De acuerdo al resultado, será necesario o no la evaluación de mutaciones en MLH1. La presencia de MSI-H con ausencia de otras proteínas orienta a continuar con la búsqueda de mutaciones en el gen correspondiente a la proteína ausente. En Mendoza se cuenta con la metodología para analizar los primeros pasos de este algoritmo y esperamos que en los años sucesivos se pueda seguir avanzando. Esto permitirá mejorar el estudio de los pacientes con Síndrome de Lynch y de este modo mejorar la calidad de vida de los pacientes y de sus familiares al realizar medidas preventivas y de vigilancia del cáncer y no de tratamiento de la enfermedad ya avanzada. Los casos de CCR de la provincia podrán ser mejor estratificados y clasificados en formas esporádicas y hereditarias pudiendo ser registrados en el Registro Provincial de tumores de Mendoza con mayor certeza en cuanto a su etiología.

A largo plazo se podría tener más información acerca de la prevalencia del Síndrome de Lynch en Mendoza y un número estimado de personas que deberían ser monitoreadas para la pesquisa de este síndrome. Con esta información se podrían plantear políticas sanitarias para monitoreo de la población en pos de mejorar la prevención de CCR y la atención de pacientes.

La investigación se realizó con aporte de los siguientes subsidios: Proyecto bienal 2013-2015 SECTyP – UNCuyo y Programa subsidio Investigadores Mendocinos 2015 “Dr. Franc Bajda” Ministerio de Salud, Desarrollo social y Deportes de Mendoza.

Bibliografía

Boland R, Goel A. Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Gastroenterology.2010 June; 138(6):2073-2087. e3.

Piñol V, Castells A, Andreu M, Castellvi-Bel S, Alenda C, Llor X, Xicola R, Rodriguez-Moranta F, Payá A, Jover R, Bessa X. Accuracy of Revised Bethesda Guidelines, Microsatellite Instability, and Immunohistochemistry for the Identification of Patients With Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer. JAMA, April 27.2005; 293(16):1986-1994)

Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. J Natl Cancer.2004; 96: 261-68.

Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for Cancer Detection and Familial Predisposition: Development of International Criteria for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Cancer Research. 1998. 58:5248-5257

Drobinskaya I, Gabbert H, Moellein G, Mueller W. A New Method for Optimizing Multiplex DNA Microsatellite Analysis in Low Quality Archival Specimens. Anticancer Research 2005. 25: 3251-3258.

Nash GM, Gimbel M, Shia J, Culliford AT, Nathanson DR, Ndubuisi M, Yamaguchi Y, Zeng ZS, Barany F, Paty PB. Automated, multiplex Assay for High –Frequency Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology.2003. 21(6):3105-3112

Perez-Carbonell –L, Alendra C, Payá A et al. Methylation Analysis of MLH1 Improves the Selection of Patients for Genetic Testing in Lynch Syndrome. JMD.2010.10(4): 498-504

Benlloch S, Payá A, Alendra C et al. Detection of BRAF V600E Mutation in Colorectal Cancer. JMD 2006.8(5):540-654

www.msal.gov.ar/inc. Instituto Nacional del Cáncer.

Gualdrini U, Iummato L. Evidencia científica y recomendaciones de prevención secundaria en los grupos de riesgo mayor (moderado y alto) de cáncer colorrectal. En Gualdrini U, Iummato L. Cáncer colorrectal en la Argentina. Organización, cobertura y calidad de las acciones de prevención y control. 2011.(55-126). Buenos Aires. Argentina

Gualdrini U, Pesquisa del cáncer colorrectal. Primer encuentro virtual de la Gastroenterología. http://www.intramed.net/sitios/gastrovirtual/4_cacolorectal.pdf

Hedge M, Ferber M, Mao R, Samowitz W, Ganguly A.  ACMG technical standards and guidelines for genetic testing for inherited colorectal cancer (Lynch syndrome, familial, adenomatous polyposis, and MYH- associated polyposis). Genetics in Medicine 2014:16(1):101-116

Pagin A, Zerimech F, Leclerc J, Wacrenier A, Lejeune S, Descarpentries C, Escande F, Porchet N, Buisine MP. Evaluation of new panel of six mononucleotide repeat markers for the detection of DNA mismatch repair- deficient tumours. British Journal of Cancer. 2013. 108, 2079-2087.

Buza N, Ziai J, Hui P. Mismatch repair deficiency testing in clinical practice. Expert Review of Molecular Diagnostics. 2016. 16:5 591-604

Gatalica Z, Vranic S, Xiu J, Swensen J. High microsatellite instability (MSI-H) colorectal carcinoma: a brief review of predictive biomarkers in the era of personalized medicine. Familial Cancer. 2016. DOI 10.1007/s10689-016-9884-6

Shia J. Immunohistochemistry versus Microsatellite Instability Testing For Screening Colorectal Cancer Patients For Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome. JMD. 2008.10:4 293-300

Giardello F, Allen J, Axilbund J, Boland R, Burke C, Burt R, Church J, Diminitz J, Johnson D, Kaltenbach T, Levin T, Lieberman D, Robertson D, Syngal S, Rex D. Guidelines on Genetic Evaluation and Management of Lynch Syndrome: A Consensus Statement by the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Dis Colon Rectum. 2014; 57(8):1025-48

Suraweera N, Duval A, Reperant M, Vaury C, Furlan D, Leroy K, Seruca R, Iacopetta B, Hamelin R. Evaluation of Tumor Microsatellite Instability Using Five Quasimonomorphic Mononucleotide Repeats and Pentaplex PCR. Gastroenterology 2002, 123:1804-1811

Kloor M, Staffa L, Ahadova A, von Knebel Doeberitz M. Clinical significance of microsatellite instability in colorectal cancer. Langerbecks Arch Surg (2014) 399:23-31

Sitios Web: 

http://www.msal.gov.ar/inc/

http://www.unidiversidad.com.ar/una-nueva-tecnica-para-pronosticar-el-cancer-colorrectal-hereditario