Salud

Diagnóstico temprano de lesiones potencialmente malignas y cáncer oral de células escamosas. “Un Puente entre la Ciencia y la Estomatología Clínica”

INTRODUCCIÓN

Epidemiología del Cáncer Oral

El cáncer oral de células escamosas (OSCC), ocupa el octavo lugar en el ranking mundial de incidencia de cáncer (2,1% del total a nivel mundial) según la OMS (Ferlay et al., 2015). Cuando hablamos de OSCC este comprende las partes blandas de la boca: lengua, paladar, encías, labios, mejillas y piso de lengua. Siendo en un 90% de los casos, lesiones orales cancerosas originadas en el epitelio de células escamosas de la mucosa oral (Allegra, Lombardo, Puzzo, & Garozzo, 2009; Coleman et al., 2008; Coleman et al., 2004; Williams, 2000). En Argentina se detectan 3.000 casos de OSCC nuevos por año, de los cuales fallecen 1.000 enfermos en el mismo período, representando así aproximadamente 2 personas fallecidas por día por OSCC. Los tratamientos utilizados son los estándar para diversos cánceres (cirugía y radioterapia). Si bien son efectivos en un 50% de los casos, cuando el tumor es detectado y tratado en etapa temprana, la tasa de mortalidad no ha cambiado en los últimos 5 años y la de supervivencia es baja, con un 40% de casos que presentan recidivas (Hill & Price, 1994; Zini, Czerninski, Vered, Livny, & Sgan-Cohen, 2009). Desafortunadamente, la mayoría de los casos de OSCC se diagnostican en etapas tardías y por lo general los pacientes fallecen dentro de los primeros 30 meses (Bota, Lyons, & Carroll, 2017; Hill & Price, 1994; Zini, Czerninski, & Sgan‐Cohen, 2010). La tasa de supervivencia es de 5 años en etapas tempranas (I, II), sin embargo en pacientes de etapas avanzadas (III y IV) no supera el 12%. La OMS prevé un aumento mundial significativo de la incidencia de OSCC en las próximas décadas (http://www.who.int/cancer/prevention/diagnosis-screening/oral cancer/en/).

En Argentina el Ministerio de Salud a través del Programa Nacional de Cáncer Bucal (PRONACABU), en conjunto con el Instituto Nacional del Cáncer y programas de cáncer oral provinciales, está recabando datos epidemiológicos debido al incremento en el número de casos (http://www.faosdir.org.ar/pdf/Resolucion754-E-2017).

Diagnóstico actual del OSCC

A la fecha el diagnóstico más utilizado es la biopsia y posterior análisis de la anatomía patológica, identificando: cambios en el tejido, presencia de células neoplásicas e inflamación e invasión (Patton, Epstein, & Kerr, 2008). Si bien el resultado es bastante informativo, con frecuencia puede conducir a resultados erróneos dependiendo de la zona de la toma de muestra y del estado molecular de esas células preneoplásicas o neoplásicas. A su vez, estas lesiones suelen confundirse con otras lesiones no cancerosas en la mucosa oral, dónde el epitelio presenta alteraciones e inflamación pero no asociado a un proceso tumoral, en especial si la lesión es muy heterogénea y la zona de la toma de biopsia no es la más representativa (Michailidou, Markopoulos, & Antoniades, 2008; Woolgar & Triantafyllou, 2009). Esto muchas veces puede resultar en una de las más grandes limitaciones inherentes al diagnóstico y la estratificación, mediante inexactitudes en la detección histológica y mala interpretación de la misma (Dionne, Warnakulasuriya, Binti Zain, & Cheong, 2015; Napier & Speight, 2008; Speight & Morgan, 1993). En los últimos años, ha habido diversos estudios para mejorar el diagnóstico de la enfermedad, utilizando biomarcadores moleculares.

Biomarcadores moleculares

 Una buena parte de la investigación clínica actual se centra en la identificación de las contribuciones de ciertos genes en la carcinogénesis, estadio del tumor y del resultado clínico. Aunque las alteraciones de algunos genes han sido identificadas durante la carcinogénesis, estos genes también están presentes en otros procesos no tumorales, por lo que no necesariamente alteraciones en su expresión estén directamente relacionadas con la presencia de lesiones tumorales (Jia et al., 2010; Zimmermann, Park, & Wong, 2007; Zimmermann & Wong, 2008). Otros genes tejido-específicos, muestran alteraciones en algunos cánceres que permiten su elección a la hora del diagnóstico (ej., BRCA1, BRCA2, en cáncer de mama). Cambios en la expresión de genes asociados a proliferación y migración celular (β-Catenina), inflamación (Nf-KB), arresto de ciclo celular (TP53) y metabolismo (CYP4B1), pueden servir para diagnosticar el estadio de lesiones potencialmente malignas de la mucosa oral, a nivel molecular durante la progresión natural del OSCC, acompañando de manera más asertiva el diagnóstico histológico. En base a ésto, en este estudio propusimos analizar el estado molecular de las LMPO y lesiones de OSCC para estadificar la lesión y acompañar de manera más asertiva el diagnostico actual.

“Un puente entre la Ciencia y la Estomatología Clínica”

La Estomatología, es parte de la medicina que se ocupa de la anatomía, la fisiología y las enfermedades de las partes blandas de la boca y sus estructuras, como paladar, mejillas, encías, lengua, piso de boca, paladar blando, labios, etc. Para poder abordar esta problemática de salud dentro del campo de la medicina oral, generamos un equipo de trabajo transdisciplinario compuesto por diversos agentes: a) Investigadores de CONICET e investigadores extranjeros de los países vecinos del cono sur, Brasil y Chile; b) Odontólogos Estomatólogos pertenecientes al SEMEB de la Facultad de Odontología, de la UNCuyo, siendo una de ellas la Od. Esp. Judith Parra, referente en nuestra provincia del PRONACABU, Ministerio de Salud l, Argentina; c) Cirujanos de cabeza y cuello de Argentina y Chile; d) Oncólogos del Centro Oncológico Regional de Mendoza, Argentina y del Instituto Nacional del Cáncer, Chile, etc.

Gracias a este equipo, hemos podido recabar datos epidemiológicos provinciales, nacionales e internacionales acerca de prevalencia e incidencia de lesiones potencialmente malignas en la mucosa oral, así como avanzar en el reclutamiento de pacientes para el estudio del diagnóstico molecular temprano y la identificación de estas lesiones, mediante jornadas de entrenamiento especializadas para estomatólogos y odontólogos de la provincia.

El objetivo de este trabajo fue evaluar y comparar a nivel molecular, biopsias de pacientes con lesiones LPMO o con OSCC, y analizar cambios tanto a: i) nivel estructural (alteraciones del tejido); ii) cambios en la abundancia y distribución de proteínas relacionadas con migración (β-Catenina) y arresto celular (TP53) y iii) Cambios en la expresión de genes asociado a inflamación (β-Catenina, Nf-KB) y asociados a metabolismo celular (TP53 y CYP4B1).

METODOLOGÍA

Población de estudio. Se reclutaron pacientes con LMPO (n=10) y con OSCC (n=10) y fueron sometidos a la toma de biopsia de rutina. Los pacientes firmaron un consentimiento informado para participar del estudio. El presente proyecto fue visado y aprobado por el comité de bioética de la Facultad de Ciencias Médicas de la UNCuyo.  

Análisis histológico. Las biopsias se procesaron para diagnóstico histológico por Hematoxilina & Eosina (H&E), y el análisis lo realizaron dos patólogos orales independientes.

Análisis por Inmunohistoquímica (IHQ). Las biopsias se procesaron para diagnóstico histológico por IHQ. Para ello se incubaron 24 horas con sondas específicas para las proteínas de interés, se revelaron con un colorante cromógeno que viró al marrón de ser positiva la marca para la proteína estudiada, y sin color cuando fueron negativas para la misma, de acuerdo a lo recomendado por el fabricante (Vector Labs).

Cuantificación de la expresión génica. Para análisis por biología molecular, las muestras se procesaron y el material genético se obtuvo según las recomendaciones del fabricante para extracción de ácidos nucleicos. Se usó un estándar molecular para las mediciones.

Análisis de los datos. El análisis estadístico de los datos entre los grupos LMPO y OSCC se realizó por Test Student no pareado. Mientras que los datos obtenidos de la cuantificación de la expresión génica, se analizaron por Anova de una vía con un post hoc de Dunn’s. Las diferencias se consideraron significativas con un p<0.05 para todos los casos.

RESULTADOS

LPMO y OSCC presentan diferentes alteraciones en la organización de las células que componen la mucosa oral normal. Biopsias orales de pacientes con LPMO versus lesiones con OSCC fueron analizadas por H&E. Se observó en todos los casos que las LPMO no presentaron células epiteliales invadiendo el estroma, aunque si se observó un engrosamiento del epitelio y leve inflamación. Por el contrario, en las biopsias de pacientes con OSCC se vio un engrosamiento epitelial significativo y desorganizado, presencia de células con núcleos anormales (de gran tamaño), presencia de estructuras de queratina con forma de perlas en el estroma y severa inflamación (Figura 1A-F). 

Figura 1. La arquitectura del epitelio oral se altera durante la progresión de OSCC. Imágenes representativas de cada estadío analizadas mediante H&E, obtenidas a 10X y 40X con microscopio de campo claro a partir de biopsias de mucosa oral de pacientes con LPMO u OSCC. El análisis y clasificación de las lesiones fueron realizadas en ciego por dos observadores independientes. Datos representativos (n=10 para cada estadío). Barra 50 um.

Las proteínas β-Catenina y TP53 se expresan de manera diferencial en lesiones de la mucosa oral y eso se asocia al pronóstico. La abundancia y distribución de proteínas involucradas en procesos tales como la proliferación y migración celular (β-Catenina) y en control del ciclo celular (TP53) fueron evaluadas en las biopsias de pacientes con LMPO versus OSCC mediante IHQ. Se observó que β-Catenina estaba muy aumentada en las biopsias de OSCC comparado con LMPO. Por otra parte, en el caso de TP53 se observó una gran disminución de esta proteína en lesiones con OSCC respecto de LMPO (Figura 2A-B) asociándose estos resultados con un peor pronóstico.

Figura 2. La abundancia y distribución de β-Catenina y TP53 se altera durante la progresión de OSCC. Imágenes representativas de biopsias de mucosa oral de pacientes con LPMO u OSCC, analizadas mediante IHQ para β-Catenina y TP53. La marca positiva (coloración marrón) se semicuantificó con el software Fiji Image J (NIH, USA), tal como muestra el gráfico de barras a la derecha de cada imagen. Los núcleos se contrastaron con hematoxilina (azul). Datos representativos (n=10 para cada estadío). Barra 50 um

La expresión de los genes β-Catenina, P53, NF-kB y CYP4B1 en la mucosa oral se alteran durante la progresión del OSCC. Los niveles de mRNA de β-Catenina y TP53 disminuyeron significativamente de forma progresiva entre los diferentes estadios de OSCC. Contrariamente, los niveles de mRNA de Nf-KB y CYP4B1, aumentaron significativamente durante la progresión del OSCC y esto se asoció a un peor pronóstico (Figura 3).

Figura 3. Genes asociados a migración, control del ciclo celular, inflamación y metabolismo cambian su expresión durante la progresión del OSCC. Cambios en la expresión génica de β-Catenina, TP53, Nf-KB y CYP4B1 fueron analizados por RT-qPCR a partir de biopsias de mucosa oral de sujetos normales y pacientes con LMPO u OSCC. Datos representativos (n=10 para cada estadío).

CONCLUSIÓN

 En lesiones de OSCC, el epitelio mostró alteraciones tales como invasión de células epiteliales en el estroma e infiltrado leucocitario severo (inflamación severa). Todo esto compatible con un peor pronóstico según lo observado por histología. Los cambios observados en las biopsias respecto de la abundancia y distribución de las proteínas β-Catenina y TP53 fueron evidentes entre ambos estadios (LMPO versus OSCC), siendo esto asociado con el fenotipo de las lesiones. En base a estos, es posible discernir el grado de indiferenciación de las lesiones y su asociación con un peor pronóstico en el caso del OSCC, dado que proteínas asociadas a migración y en menor grado proliferación celular, tales como β-Catenina están aumentadas, mientras que TP53 que es conocida por su rol como “guardián molecular” coordinando el arresto celular, se encuentra significativamente disminuida en pacientes con OSCC. Ambos resultados se condicen con lo reportado en la literatura por Gonzáles y cols  entre otros investigadores (Zini et al.). 

Respecto del estatus molecular de estas lesiones, observamos que el gen de β-Catenina disminuyó su expresión significativamente en pacientes con OSCC en comparación con pacientes con LMPO. En el caso de TP53, se observó una significativa disminución de la expresión génica durante la progresión tumoral, lo que se condice con lo descripto para la mayoría de los cánceres dónde TP53 no está mutada (zur Hausen). Respecto de la expresión del gen Nf-KB (asociado a inflamación) y CYP4B1 (asociado a metabolismo celular), se observaron significativamente aumentados en pacientes con OSCC. Esto se condice con lo descripto en la literatura durante la progresión tumoral y el aumento de componentes inflamatorios que conducen a un proceso crónico que desenlaza un círculo vicioso (el tumor es una herida que nunca sana), tal como lo describen algunos autores. En el caso de CYP4B1 (detoxificación celular), es el primero que se describe alterado ante procesos de daño crónico, generando especies oxidativas que conducen a daño del DNA y acumulación de mutaciones en la célula dañada (Zoppino, Guerrero-Gimenez, Castro, & Ciocca).

Nuestros resultados sugieren que los cambios observados tanto a nivel de la expresión génica β-Catenina, P53, NF-kB y CYP4B1, como a nivel abundancia y distribución de las proteínas codificadas por algunos de estos genes tales como  β-Catenina y TP53, pueden usarse para describir el estadio molecular de lesiones de la mucosa oral LMPO y de OSCC. Estos biomarcadores moleculares (expresión de genes y proteínas), tienen el potencial para ser aplicados como posible método de diagnóstico precoz, para acompañar de forma más asertiva el diagnóstico histológico de rutina. Dado que mediante análisis histológico vemos fenotipo de la lesión pero desconocemos su genotipo. Por lo que una lesión que fenotípicamente se clasifique como LMPO puede ser genotípicamente OSCC. Este tamizaje molecular podría determinar el éxito del diagnóstico y el manejo del paciente.

La generación de nuevas políticas públicas en el ámbito de la salud, particularmente en el área de la odontología y la estomatología, resulta de gran importancia para anticipar el diagnóstico, entrenar y concientizar a profesionales del área y a la población en general, tanto en el autoexamen como en el conocimiento de la patología, y a su vez actualizar las bases de datos epidemiológicos nacionales y provinciales. Dado este escenario es que los autores del presente estudio, trabajamos de manera coordinada a nivel nacional con PRONACABU, IMBECU-CONICET, FOdonto UNCuyo y a nivel provincial con el departamento de odontología del Ministerio de Salud de Mendoza.

Conflicto de interés. Los autores no declaran tener conflicto de interés alguno.

Financiamiento. El presente trabajo se realizó con financiamiento del Laboratorio de Hormonas y Biología del Cáncer, IMBECU CCT-Mendoza, CONICET y la Facultad de Odontología, UNCuyo.

Referencias

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